功能化乙二醇壳聚糖/PLGA/胸腺五肽纳米粒的制备和口服药效学考察

【摘要】胸腺小肽是由胸腺生成素Ⅱ活性中心氨基酸残基片段构成的短肽，包括胸腺五肽（Thymopentin，TP5）、胸腺四肽（Thymocarti，TP4）和胸腺三肽（Thymotrina，TP3），它们保留了胸腺生成素的所有生物活性，能够双向调节机体免疫功能。目前，临床上使用的是TP5肌肉或静脉注射液。口服给药是替代注射给药的最佳方式，然而与其他多肽类药物一样，胃肠道中的稳定性差和小肠透过率低是TP5无法实现口服给药的主要原因。为了实现对胸腺小肽的保护，本文分别设计合成了由酶抑制剂Bestatin和EDTA修饰的乙二醇壳聚糖(GlycolChitosan，GCS)，并对合成材料进行了酶抑制功能评价。此外，本文还尝试用这种功能化材料对PLGA载药纳米粒进行包衣，并初步考察了其口服药效学效果。首先，本文在催化条件下，实现了酶抑制剂Bestatin与GCS的直接连接，经纯化得到GCS-Bestatin。另外，以甘氨酸（gly）为linker，合成了GCS-gly-Bestatin。红外和荧光光谱学实验结果表明，GCS-Bestatin和GCS-gly-Bestatin主要是通过酰胺键实现的共价连接，而在GCS-gly-Bestatin中还包含少量酯键的形成；另外发现，Bestatin在GCS-gly-Bestatin上的质量分数较GCS-Bestatin高出一倍左右。此外，本文还合成了EDTA修饰的GCS。红外光谱实验结果表明，EDTA借助其羧基和GCS糖环上氨基之间形成的酰胺键实现与GCS的共价连接。随后，本论文对上述合成产物的酶抑制效果进行了考察，并对GCS-Bestatin与氨肽酶的结合机制进行了探索性研究。体外酶抑制实验结果表明，GCS-Bestatin和GCS-gly-Bestatin均具有对氨肽酶的抑制活性，且相同条件下GCS-Bestatin的抑制能力要高于GCS-gly-Bestatin。通过N-乙酰-L-Leu与GCS-Bestatin的竞争性结合氨肽酶的实验，我们推测与GCS连接之后的Bestatin仍然具有与氨肽酶分子S1’疏水袋结合的能力。此外，合成的GCS-EDTA能够竞争钙黄绿素中的钴离子，说明该合成产物仍具备金属离子螯合能力。最后，本论文采用水/油/水乳化-溶剂挥发法制备了TP5的PLGA纳米粒，并以粒径和包封率为评价指标，对处方进行了优化。最终选择以功率40%超声50s，外水相PVA浓度3%（w/v），130mg/mL的PLGA浓度，以及50μl的内水体积来制备纳米粒。以此为基础，我们分别制备了用GCS、GCS-Bestatin和GCS-EDTA包衣的PLGA纳米粒。实验结果表明，功能化GCS包衣对纳米粒粒径和包封率影响不大，粒径约为250nm，包封率约为30%；GCS和GCS-Bestatin包衣纳米粒的表面带正电，而未包衣PLGA纳米粒和GCS-EDTA包衣纳米粒的表面带负电。透射电镜结果表明，纳米粒呈球形，粒径分布均一。随后，通过免疫抑制小鼠灌胃给药，对上述纳米粒口服后的药理作用进行初步考察。结果显示灌胃GCS-Bestatin和GCS-EDTA包衣纳米粒的小鼠，其外周血的CD4+/CD8+要高于口服TP5溶液组，具有显著性差异。后续的药效学研究将在模型小鼠进一步完善之后开展。综上，本研究表明，将Bestatin或EDTA连接到生物粘附性大分子GCS上，能够赋予GCS酶抑制剂功能，以上述两种功能化GCS来修饰包载TP5的PLGA纳米粒有望实现TP5的口服给药。
【作者】冯娇；
【导师】陈妍；张勇；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】胸腺小肽；乙二醇壳聚糖；功能化修饰；PLGA纳米粒；口服载体；

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